Neural grafts: new perspectives on the development and repair of the nervous system

Neural grafts:
new perspectives on the development and repair of the nervous system
9 -14 May, 1995
Organisers : Nicole Le Douarin, Constantino Sotelo

Participants :

Rosa-Magdalena Alvarado-Mallard (Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM), hôpital de la Salpêtrière, Paris), Evan Balaban (The Neurosciences Institute, San Diego, USA), Cesira Batini (Centre national de recherche scientifique (CNRS), laboratoire de physiologie de la motricité, Paris), Anders Björklund (Université de Lund, Suède), Peter Coffey (University of Sheffield, UK), Manfred Gahr (Max-Planck-Institute for Behavioural Physiology, Allemagne), Anne Grapin (Institut d’embryologie cellulaire et moléculaire du CNRS et du Collège de France, Nogent-sur-Marne), Marc Hallonet (Max Planck-Institut, Göttingen, Allemagne), Ann Kato, Université de Genève, Suisse), Masae Kinutani (Ehime University School of Medicine, Japon), Nicole Le Douarin, organisateur (Institut d’embryologie cellulaire et moléculaire du CNRS et du Collège de France, Nogent-sur-Marne), Jacques Mallet (CNRS, Gif-sur-Yvette), Ronald McKay (LMB/NINDS, Bethesda, USA), Harukazu Nakamura (CNRS, Gif-sur-Yvette, France), Robert Naquet Institut (Alfred-Fessard, CNRS, Gif sur-Yvette, France), Olivier Pourquié (Institut d’embryologie cellulaire et moléculaire du CNRS et du Collège de France, Nogent-sur-Marne, France), Ferdinando Rossi (Université de Turin, Italie), Gary Schoenwolf (University of Utah School of Medicine, Salt Lake City, USA), Constantino Sotelo (Hôpital de la Salpêtrière, Paris, France), Marie-Aimée Teillet (Institut d’embryologie cellulaire et moléculaire du CNRS et du Collège de France, Nogent-sur-Marne, France), Kathryn Tosney (University of Michigan, Ann Arbor, Etats-Unis), Marion Wassef (CNRS, Paris).

Titles of presentations:

Rosa Magdalena Alvarado-Mallart – Chick/quail chimeras to study the development of the mesisthme-cerebellar region

Evan Balaban – Neural transplants for dissecting species behavioral differences

Cesira Batini – Neural grafts in the study of epilepsy

Anders Björklund – Use of conditionally immortalized neural progenitor cells for repair of the damaged central Nervous System

Peter Coffey – Retinal transplantation as a model System to examine functional capacities of neural transplants

Manfred Gahr – Brain differentiation in male-female chimeras

Anne Grapin-Botton – Determination of the anteroposterior identity in the avian brain

Marc Hallonet – Studies on cerebellar development using the quail/chick chimera System

Philippe Horellou – Gene therapy in an animal model for Parkinson’s disease

Ann Kato – Polymer encapsulated cell lines genetically engineered to release ciliary neurotrophic factor can slow down progressively motor neuronopathy in the mouse

Masae Kinutani – Does the vagal neural crest have the segmented origin and distribution in the gut?

Nicole Le Douarin

– Fate-mapping of the anterior neural primordium in quail-chick chimeras

– Immunology of neural hetero- and homospecific chimeras

Jacques Mallet – Direct gene transfer in the brain

Ronald McKay – Differentiation of mammalian neuroepithelial stem cells in vitro and in vivo

Harukazu Nakamura – Mechanisms of the establishment of rostrocaudal polarity of the optic tectum

Robert Naquet – Neural grafts in the study of epilepsy

Olivier Pourquié – The use of quail-chick chimeras for tracing axonal pathways in the central nervous System

Ferdinando Rossi – Neural transplantation studies on cell commitment and differentiation in rodent cerebellar ontogeny

Gary Schoenwolf – Transplantation at gastrula stages of avian embryos: cell marking in mouse embryos

Constantino Sotelo – Neuronal transplantation in rodents as an approach to study cerebellar development

Marie-Aimée Teillet – A long term study of embryonic avian brain chimeras

Kathryn Tosney – Grafts and axon guidance in the developing nervous System

Marion Wassef Wnt-1 is involved in the formation of the met/mesencephalic boundary

Articles available in the archives of the Fondation des Treilles

Erickson, C.A. – Duong, T. D. – Tosney K. W.
Descriptive and Experimental Analysis of the Dispersion of Neural Crest Cells along the Dorsolateral Path and Their Entry into Ectoderm in the Chick Embryo
Developmental Biology, 151, 1992, pp. 251-272

Schlosser, G. – Tosney K. W.
Projection-Neurons That Send Axons through the Lumbar Spinal Cord of the Chick Embryo Are Not Obviously Distributed in a Segmentally Repetitive Pattern
Journal of Neuroscience Research, 21, 1988, pp. 410-419

Tyrrel, Sophia et al.
Distribution and Projection Pattern of Motoneurons That Innervate Hindlimb Muscles in the Quail
The Journal of Comparative Neurology, 298, 1990, pp.413-430

Tosney, Kathryn W. – Hageman, Martha S.
Different Subsets of Axonal Guidance Cues Are Essential for Sensory Neurite Outgrowth to Cutaneous and Muscle Targets in the Dorsal Ramaus of the Embryonic Chick
The Journal of Experimental Zoology, 251, (1989), pp. 232-244

Oakley, Robert A. – Tosney, Kathryn W.
Peanut Agglutinin and Chondroitin-6-sulfate Are Molecular Markers for Tissues That Act as Barriers to Axone Advance in the Avian Embryo
Developmental Biology, 147, 1991, pp. 187-206

Tosney, Kathryn W.
Somites and Axon Guidance
Scanning Microscopy, Vol. 2, No. 1, 1988, pp. 427-442

Tosney, Kathryn W.
Cells and Cell-Interactions that Guide Motor Axons in the Developing Chick Embryo
BioEssays, Vol. 13, No. 1, January 1991, pp. 17-23

Tosney, Kathryn W.
The Early Migration of Neural Crest Cells in the Trunk Region of the Avian Embryo: An Electron Microscopic Study
Developmental Biology, 62, 1978, pp. 317-333

Tosney, Kathryn W.
The Segregation and Early Migration of Cranial Neural Crest Cells in the Avian Embryo
Developemental Biology, 89, 1982, pp. 13-24

Tosney, Kathryn W. – Landmesser, Lynn T.
Specificity of Early Motoneuron Growth Cone Outgrowth in the Chick Embryo
The Journal of Neuroscience, Vol. 5, No. 9, September 1985, pp. 2336-2344

Tosney, Kathryn W. – Landmesser, Lynn T.
Growth Cone Morphology and Trajectory in the Lumbosacral Region on the Chick Embryo
The Journal of Neuroscience, Vol. 5, No. 9, September 1985, pp. 2345-2358

Tosney, Kathryn W.
How to dissect an egg. Or, a beginners’ guide to embryonic surgery
Fine Science Tools Inc., Vol. 2, No 1, March 1988, pp. 1-4P

Tosney, Kathryn W.
Proximal Tissues and Patterned Neurite Outgrowth at the Lumbosacral Level of the Chick Embryo: Deletion of the Dermamyotome
Developmental Biology, 122, 1987, pp. 540-558

Tosney, Kathryn W.
Proximal Tissues and Patterned Neurite Outgrowth at the Lumbosacral Level of the Chick Embryo: Partial and Complete Deletion of the Somite
Developmental Biology, 127, 1988, pp. 266-286

Coffey, P J. – Lund, R. D. – Rawlins, J. N. P.
Retinal Transplant-mediated learning in a conditioned suppression task in rats
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 86, September 1989, pp. 7248-7249

D. Lund and P.J. Coffey
Visual information processing by intracerebral retinal transplants in rats
Eye (1994), 8, 263-268 ©1994 Royal College of Ophthalmologists

Lund, Raymond D. et al.
Developmental and Functional Integration of Retinal Transplants with Host Rat Brains
In “Brain Repair” (Palgrave – June 1990) = Chapter 24, pp. 328-340

Review (in French) :

Le but de ce symposium était de faire le point sur l’apport de la méthode des greffes de cellules et de tissu neural dans deux domaines, celui du développement et celui de la pathologie traumatique ou dégénérative du système nerveux.

Le symposium a ainsi rassemblé des chercheurs travaillant à différents niveaux d’organisation : celui de la molécule, de la cellule et de l’organisme entier.

Greffes neurales et développement du système nerveux

Les greffes de cellules neurales dans l’embryon ont apporté des données fondamentales à notre connaissance du développement précoce du système nerveux. Celui-ci fait intervenir des migrations cellulaires étendues qui jouent un rôle essentiel dans la mise en place du réseau des connexions neuronales qui, elles-mêmes, sous-tendent le fonctionnement du système nerveux central et périphérique.

Les migrations accomplies par les cellules dans l’embryon sont difficiles à suivre, car elles se produisent en général à des stades où les cellules migrantes sont encore indifférenciées et ne se distinguent pas de celles des tissus, tout aussi indifférenciés, au sein desquels elles se meuvent. Il est donc nécessaire de “marquer”, d’une manière ou d’une autre, les cellules potentiellement migratrices avant qu’elles ne se mettent en mouvement.

Diverses méthodes sont utilisées dans ce but, qui présentent les unes et les autres des avantages et des inconvénients. Le marquage des cellules par injection iontophorétique intracellulaire d’un colorant vital a l’avantage d’être précis, mais l’inconvénient de ne concerner qu’un nombre très limité de cellules, dont on ne peut suivre la destinée que pendant une courte période à cause de la dilution du marqueur. Les colorants lipophiles, tels que le DiI (dicarbocyanine dye), qui s’intègrent à la membrane cellulaire, ont l’avantage d’être d’un emploi facile, mais l’inconvénient de conférer un marquage peu précis et d’une durée limitée. L’utilisation de virus portant un gène “reporter”, tels que Lac Z codant pour l’enzyme β-galactosidase, qu’on peut mettre en évidence dans les cellules infectées par une réaction cytochimique simple, a apporté des résultats intéressants pour l’étude des lignages cellulaires dans le système nerveux des mammifères, dont l’accès est difficile au cours de la vie embryonnaire. Cependant, cette méthode, qui confère un marquage à des cellules sélectionnées au hasard de l’infection virale, pose de nombreux problèmes d’interprétation et ne peut être utilisée que pour aborder quelques questions spécifiques de lignage cellulaire.

L’embryon d’oiseau, très proche de celui des mammifères, se prête particulièrement bien à l’étude de la morphogenèse et de l’organogenèse par son accessibilité dans l’œuf pendant toute la durée du développement embryonnaire. Une méthode performante pour l’étude des migrations cellulaires chez l’embryon d’oiseau a été mise au point par Nicole Le Douarin en 1969. Elle consiste dans l’association de cellules de deux espèces d’oiseau proches sur le plan taxonomique, la caille et le poulet. Les cellules de ces deux espèces sont identifiables dans les embryons chimères ainsi construits, grâce à la structure de leur noyau interphasique ou par le moyen d’anticorps ou de sondes nucléiques spécifiques de l’une ou l’autre espèce. Le marquage ainsi obtenu est à la fois précis et permanent.

Marie-Aimée Teillet (Institut d’embryologie cellulaire et moléculaire du Collège de France et du CNRS, Nogent-sur-Marne) a présenté l’historique et les principaux acquis de cette technique qui a été d’abord appliquée à l’étude de la crête neurale et d’un de ses principaux dérivés, le système nerveux périphérique.

Nicole Le Douarin (Institut d’embryologie cellulaire et moléculaire du Collège de Fiance et du CNRS, Nogent-sur-Marne) a traité du rôle de la crête neurale dans la genèse de la tête chez les Vertébrés et de l’importance évolutive de cette structure au sein des groupes de Cordés.

L’application de la méthode des chimères caille-poulet à l’étude de la mise en place des ébauches embryonnaires chez les vertébrés amniotes a été décrite par Gary Schoenwolf (université de Utah, États-Unis). Dès le stade gastrula, en transplantant de petits groupes d’environ 300 cellules, il établit une carte présomptive de l’embryon de poulet, assignant ainsi à chaque territoire embryonnaire un devenir précis dans l’embryon futur.

Cette information est très intéressante, car elle permet de connaître les transformations morphogénétiques qui affectent les territoires embryonnaires précoces et sculptent ainsi la forme des organes et du corps, spécifique de chaque espèce vivante. Elle permet ensuite d’aborder l’étude des mécanismes responsables de la morphogenèse et des gènes qui la contrôlent. Ainsi, Gary Schoenwolf dresse une véritable carte des territoires présomptifs de l’embryon au stade où la gastrulation se produit (stade de la ligne primitive) et montre qu’à ce stade ces territoires, bien que nettement délimités, sont encore plastiques.

Par exemple, des cellules à destinée mésodermique transplantées dans la position des territoires neurectodermiques formeront du tube neural. Le territoire qui donne naissance à la notochorde, qui est souvent présentée comme un centre organisateur des autres tissus, peut lui même être régénéré après son ablation totale ou partielle.

Nicole Le Douarin analyse le processus, peu étudié jusque-là, de neurulation secondaire et montre qu’il consiste dans la poursuite des processus de gastrulation primaire. Le tube neural se forme alors par cavitation à partir du bourgeon caudal, qui apparaît comme une structure régionalisée et non comme un “blastème” inorganisé, comme le pensent encore certains auteurs. Les cellules les plus caudales donneront naissance au mésoderme en migrant rostrolatéralement. Rostralement, les cellules formeront la notochorde et la plaque du plancher (floor plate) ; enfin, entre ces deux territoires, se trouvent les précurseurs du tube neural, moins la plaque du plancher. Il est intéressant de souligner que les cellules de la notochorde et de la plaque du plancher, dont on savait qu’elles exprimaient de nombreux marqueurs communs, se trouvent réunies par leur territoire d’origine. Ces notions nouvelles modifient les conceptions classiques selon lesquelles la floor plate fait originellement partie de la plaque neurale et se différencie sous l’effet d’une induction émanant de la notochorde. En fait, ces deux structures ont une origine commune et la floor plate s’intègre secondairement à la plaque neurale primitive.

Nicole Le Douarin décrit ensuite les mouvements morphogéniques de l’ébauche neurale au niveau de la tête. La partie antérieure du tube neural, qui ne donnera pas de crête neurale, s’enroule autour de l’axe fictif marqué par l’extrémité rostrale de la notochorde en plongeant vers le bas. Le télencéphale ne prend donc pas naissance à l’extrémité du tube neural, mais plus caudalement et latéralement. Ce mouvement plongeant amène en contact, l’un sur l’autre, des territoires initialement adjacents dans la plaque neurale, ceux de l’hypophyse et de l’hypothalamus. L’extrémité de la notochorde est non seulement un axe virtuel de rotation, mais elle marque aussi la limite au-delà de laquelle le mésoderme ne peut se différencier en structures cartilagineuses et osseuses, et donc former le crâne. Les os du crâne plus rostraux seront donc fournis par la crête neurale.

Les chimères caille-poulet ont permis de montrer, grâce aux travaux du docteur Couly (Institut d’embryologie cellulaire et moléculaire du Collège de France et du CNRS, Nogent-sur Marne), que la crête neurale est à l’origine non seulement du squelette facial, mais aussi des os de membrane de la voûte du crâne qui recouvre les hémisphères cérébraux. On assiste donc, au cours de l’évolution des Vertébrés, au développement considérable des hémisphères cérébraux et des organes des sens, accompagné de l’accroissement du squelette de la voûte du crâne destiné à les protéger. La crête neurale antérieure et le cerveau prosencéphalique et mésencéphalique ont donc évolué de concert pour élaborer le cerveau et la tête dans le phylum des Vertébrés. La discussion a porté ensuite sur l’importance d’une structure telle que la crête neurale dans la stratégie évolutive des Vertébrés.

Le niveau de précision atteint par les recherches portant sur les migrations et le devenir des cellules de la crête neurale s’est accru avec les expériences réalisées par de nombreux groupes dans le monde. Ainsi celui de Masae Kinutani (université de Ehime, Japon) a pu établir que la grande majorité des cellules qui sont à l’origine du système nerveux entérique, dont le volume chez l’adulte est de même ordre que celui du cerveau, dérivent d’une zone du névraxe de quelques centaines de microns correspondant au niveau des somites 3-4 et 5, c’est-à-dire du 8e segment rhombencéphalique (r8) et, par conséquent, d’un nombre très limité de précurseurs.

L’utilisation du système des chimères caille-poulet a permis à Marc Hallonet (Institut Max-Planck, Göttingen, Allemagne) de reconsidérer l’embryogenèse de cervelet et de montrer que, contrairement aux conceptions classiques qui en faisaient un dérivé du métencéphale, il dérive en fait seulement de la moitié rostrale du métencéphale, auquel s’ajoute la moitié caudale du mésencéphale, ce qui correspond au domaine d’expression du gène En-2. Seuls 120° dorsaux, de part et d’autre du tube neural, à l’exception du toit, contribuent au cervelet. Un mouvement morphogénétique entraîne les précurseurs les plus dorsaux rostralement, tandis que les plus ventraux formeront la partie caudale du cervelet. Ces greffes lui permettent aussi de modifier les idées admises concernant l’origine des cellules en panier et des cellules étoilées de la couche moléculaire, qui ne proviennent pas de la couche granulaire externe, mais de l’épithélium ventriculaire sous-jacent. La plupart des cellules cérébelleuses, à l’exception des cellules de Purkinje et des cellules de Golgi, qui migrent strictement radialement, effectuent de larges migrations tangentielles à la surface de l’épithélium neural, dont Marc Hallonet a étudié précisément les modalités.

Un des apports essentiels de la méthode des greffés intracérébrales embryonnaires concerne l’étude de la détermination des territoires neuraux et de leur plasticité éventuelle. Celle-ci se manifeste par leur capacité à répondre à des signaux de position émanant de territoires embryonnaires voisins. Pour tester cette plasticité, des territoires neuraux définis sont transplantés en position hétérotopique chez l’embryon jeune et leur devenir est analysé au moyen de sondes moléculaires spécifiques d’un état donné de différenciation.

Les recherches de génétique du développement poursuivies chez la drosophile ont montré que certains gènes codant pour des facteurs de transcription ont un rôle crucial dans le développement car, en régulant l’activité spatio-temporelle d’autres gènes, ils contribuent à l’établissement du plan d’organisation du corps de l’embryon, puis de l’adulte. Ces « gènes de développement » s’intègrent dans une cascade d’événements moléculaires, dont l’étude est au cœur même des recherches actuelles.

Parmi eux, les gènes homéotiques (gènes HOM-C) de la drosophile sont particulièrement intéressants. Les travaux d’Ed Lewis ont montré que, chez la mouche, ils déterminent l’identité des segments et de leurs appendices. Ils se lient à des séquences spécifiques de divers gènes par une partie très conservée de leur molécule, l’homéodomaine, constitué de 60AA, eux-mêmes codés par une séquence nucléique appelée homeobox. Ce motif est retrouvé chez pratiquement tous les êtres vivants. Chez les Vertébrés, une quarantaine de gènes homologues aux gènes HOM-C de la drosophile ont été identifiés (gènes Hox).

Leur rôle dans le développement du cerveau a été étudié par Anne Grapin-Botton (Institut d’embryologie cellulaire et moléculaire du Collège de France et du CNRS, Nogent-sur-Marne).

Elle rapporte une série d’expériences impliquant des transplantations hétérotopiques des rhombomères présomptifs (i.e. segments du cerveau postérieur des Vertébrés) au stade de 5 somites et montre que l’expression des gènes à homeobox à des niveaux précis du cerveau postérieur des Vertébrés dépend d’une information positionnelle extrinsèque, transmise à un niveau donné du névraxe par un signal transitant le long de deux voies : dans le plan du neuroépithélium lui-même et pouvant aussi se transmettre du mésoderme paraxial au tube neural. Ce signal est distribué dans l’embryon selon un gradient caudorostral décroissant. Elle montre aussi que le devenir du neuroépithélium, c’est-à-dire sa différenciation en structures neurales spécifiques d’un niveau donné, dépend du code Hox exprimé à ce niveau. Cette affirmation est fondée sur l’obtention de transformations homéotiques corrélées à une modification expérimentalement induite dans le code Hox, exprimé à un niveau donné du neuroépithélium.

Les travaux de Marion Wassef (CNRS, École normale supérieure, Paris) portent sur un autre aspect de la plasticité du neuroépithélium, au stade où l’ébauche de l’encéphale se présente sous la forme de vésicules céphaliques (pro-, més, et rhom-bencéphale), préfigurant les différents segments antéropostérieurs du cerveau futur. Elle essaie de comprendre les lois qui sous-tendent l’expression du gène Wnt-1 codant pour un facteur de croissance, dont le rôle est encore mal compris. Au stade de 10 somites chez l’embryon de poulet, le mésencéphale et le métencéphale sont séparés par la région de l’isthme, une constriction du tube neural dont Marion Wassef étudie la formation. Le gène Wnt-1 est exprimé selon un anneau dans la légion de l’isthme, ainsi que dans celle qui sépare le plexus choroïde de l’épithélium ventriculaire. Lorsqu’on transplante des territoires mésencéphaliques dans le prosencéphale, Wnt-1 est réorganisé dans le greffon. Il s’exprime à la limite du greffon en position caudale. Quand le greffon provient du métencéphale, Wnt-1 s’exprime dans le greffon entre le plexus choroïde et l’épithélium ventriculaire. De plus, le gène Wnt-1 de l’hôte est induit à la jonction entre le plexus choroïde et le greffon. Il est à noter que les résultats de cette étude et son niveau de précision ont pu être atteints grâce à la mise en œuvre du système des chimères caille-poulet, qui permettent de distinguer le greffon de l’hôte à l’échelle de la cellule unique.

Dans le mutant swaying, qui exprime une forme tronquée de Wnt-1, la limite mésencéphalo-métencéphalique est moins nette et on retrouve des cellules du mésencéphale, marquées par le gène Otx2, dans le métencéphale et vice-versa. Les cellules mésencéphaliques dispersées dans le métencéphale expriment Wnt-1, alors que les cellules métencéphaliques dispersées dans le mésencéphale ne le font pas, montrant que Wnt-1 ne peut être exprimé que dans les cellules mésencéphaliques en contact avec un tissu ectopique. Les seules cellules métencéphaliques qui peuvent exprimer Wnl-1 se situent au niveau de la jonction plexus choroïde épithélium ventriculaire. Wnt-1 participerait donc à la formation de barrières anatomiques entre territoires.

Le travail présenté par Rosa-Magdalena Alvarado-Mallart (INSERM, CHU Pitié-Salpêtrière, Paris) porte sur le déterminisme et les potentialités des divers territoires prosencéphaliques.

Les compétences de ces territoires sont testées par leur capacité à exprimer le gène régulateur En-2, dont le domaine de transcription correspond au territoire destiné à fournir le cervelet et le toit optique : la région més-métencéphalique (més-mét). Rosa-Magdalena Alvarado-Mallart a montré par des chimères caille-poulet, porteuses des greffes hétérotopiques, que le gène En-2 peut être induit ectopiquement dans les régions caudales du prosencéphale. Cette induction se traduit par la perte de l’expression Pax-6 et le devenir diencéphalique de ces régions qui adoptent un phénotype mésencéphalique. Au contraire, les territoires rostraux du prosencéphale ne sont pas induits à exprimer En-2, ni au contact d’un greffon En-2+ ni transplantés dans le domaine més-mét. Ils gardent toujours leur expression Pax-6, Emx-1 et leur phénotype télencéphalique. Toutefois, dans le territoire diencéphalique compétent, l’induction de En-2 est seulement partielle. Elle est arrêtée au niveau des limites qui séparent les trois segments prosencéphaliques (prosomères 1, 2, 3). La région non induite garde toujours son expression Pax-6 et son devenir diencéphalique, suggérant que ses limites sont essentielles pour préserver la spécificité des divers segments prosencéphaliques.

Harukazu Nakamura (Institute of Development, Aging and Cancer, Sondai, Japon) s’intéresse au même problème des relations entre l’expression du gène En-2 et la différenciation du neuroépithélium. Son travail porte particulièrement sur le toit optique (équivalent des corps genouillés des Mammifères, qui constituent des relais des voies optiques venant de la rétine et aboutissant dans les hémisphères cérébraux). Il est connu que les différentes régions du toit optique reçoivent des fibres rétiniennes provenant d’un territoire précis de la rétine. Cette spécificité régionale pose le problème de la reconnaissance des fibres rétiniennes et des neurones tectaux avec lesquels elles établissent des connexions. Harukazu Nakamura a découvert que l’expression du gène En-2 est établie dans le toit optique selon un gradient décroissant caudorostral. En-2 est exprimé fortement dans le mésencéphale postérieur qui recevra les nerfs optiques de la partie nasale de la rétine. Au contraire, il est exprimé faiblement dans le mésencéphale rostral, où les fibres temporales de la rétine se projettent. Lorsqu’on transplante à E2, en respectant son orientation antéropostérieure, un fragment de mésencéphale dans le diencéphale, le gradient de En-2 s’inverse en une journée. La vitesse de maturation du toit optique s’inverse conjointement. Les fibres originaires de la rétine sont capables d’atteindre ce toit optique ectopique et, d’une manière frappante, elles effectuent leurs projections conformément à l’expression de En-2, comme dans le développement normal.

Ces résultats suggèrent que des tissus réprimant l’expression de En-2 sont présents au niveau de la jonction diencéphalo-mésencéphalique. La surexpression de En-2 dans la totalité du mésencéphale induit une colonisation complète de celui-ci par les fibres nasales de la rétine, ce qui confirme que En-2 joue un rôle dans le développement antéropostérieur du mésencéphale et détermine la nature des cibles des axones rétiniens.

L’ensemble de ces données montre qu’à deux jours le système nerveux est encore extrêmement plastique. Certaines régions, comme l’isthme, le rhombomère 8, la jonction diencéphalo-mésencéphalique et certaines limites prosomériques ont un rôle organisateur.

Le problème de la plasticité du système nerveux est ensuite envisagé à l’échelle cellulaire. Ferdinando Rossi (université de Turin) pose la question de savoir si les cellules du cervelet post-natal, transplantées chez l’embryon, sont capables de répondre à des signaux intercellulaires de type embryonnaire par leur positionnement dans le cervelet de l’embryon hôte ou par la différenciation d’éventuelles cellules souches persistant dans le cerveau après la naissance. Il réalise des greffes provenant du cervelet postnatal de souris transgéniques exprimant le marqueur β-galactosidase sous contrôle des promoteurs de gènes exprimés dans les neurones dans des embryons de souris normales. Le transgène codant pour la β-galactosidase permet de reconnaître les cellules greffées. Il apparaît ainsi que, même si elles sont capables de répondre aux signaux intercellulaires embryonnaires (car elles s’intègrent bien dans le circuit cérébelleux embryonnaire), elles ne changent pas de phénotype.

Ces résultats montrent que les progéniteurs du cervelet postnatal sont déjà déterminés : ils ne peuvent donner lieu à d’autres types cellulaires que ceux obtenus dans l’ontogenèse cérébelleuse normale, c’est-à-dire les cellules des grains et les interneurones de la couche moléculaire (cellules étoilées et en corbeille).

Ronald McKay (National Institute of Health, Bethesda, États-Unis) a caractérisé les cellules souches du système nerveux en montrant qu’elles expriment un filament intermédiaire particulier, la nestine. Par infection virale, Ronald McKay immortalise les cellules nestine+ de l’épithélium neural et démontre 1°) qu’elles sont multipotentes ; 2°) qu’elles répondent à des signaux intercellulaires pour choisir leur voie de différenciation. Ainsi, ces cellules, placées par greffe intracérébrale dans l’hippocampe ou dans le cervelet, ont un soit différent et en accord avec la position qu’elles occupent. Ronald McKay a de plus étudié l’action de différents facteurs de croissance sur le comportement in vitro des précurseurs des neurones granulaires de l’hippocampe. Ces neurones expriment la calbindine et leur nombre augmente in vitro s’ils sont cultivés en présence de neurotrophine-3 ou de bFGF. Le bFGF agit sur la différenciation, puis, dans un deuxième temps, sur la survie et la prolifération de ces cellules. Après élimination du bFGF, les cellules se différencient en “clones” contenant des astrocytes, des oligodendrocytes et des neurones, démontrant ainsi la nature multipotente de ces cellules. L’adjonction de PDGF favorise la différenciation neuronale, le CNTF, la différenciation astrocytaire, et l’hormone thyroïdienne (T3), la différenciation oligodendrocytaire.

Constantino Sotelo (INSERM, CNRS – IFR de neurosciences, Pitié-Salpêtrière, Paris) a exposé ses travaux de neurotransplantation des cellules de cervelet embryonnaire dans le cervelet adulte de la souris mutante PCD (modèle murin d’ataxie hérédo-dégénérative systématisée). Il a montré la possibilité de remplacer une population neuronale manquante (les cellules de Purkinje, CPs), chez l’animal adulte, par des cellules embryonnaires de la même catégorie. Cette substitution neuronale a lieu avec intégration synaptique des CPs greffées dans le circuit du cortex cérébelleux receveur, entraînant la réparation partielle de ce circuit.

Constantino Sotelo s’est attaché à l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires intervenant dans la migration des CPs greffées. Les signaux moléculaires qui interviennent dans la reconnaissance entre neurones en migration et axes gliaux ne sont pas encore tout à fait connus, mais ils doivent être régulés au cours du développement et exprimés de façon transitoire. Après la phase de migration, une glie radiale modifiée persiste dans le cervelet adulte (les fibres de Bergmann), mais elle n’exprime ni les molécules de surface, ni les molécules cytoplasmiques qui interviennent pendant la migration neuronale.

Constantino Sotelo a montré que cette forme adulte de glie radiale peut être induite à ré-exprimer certains de ces composants, particulièrement la nestine) un filament intermédiaire seulement présent pendant la phase active de la migration neuronale. La migration correcte des CPs greffées à travers la couche moléculaire de l’hôte est associée à la réexpression de nestine dans les fibres de Bergmann. Ces observations soulèvent la possibilité que l’expression des composants gliaux impliqués dans la migration neuronale est inductible, chez l’adulte, par les neurones immatures adjacents.

Peter Coffey (université de Sheffield, Grande-Bretagne) s’intéresse au traitement de l’information visuelle par le cerveau, en utilisant un modèle de transplantation de rétine. Ce système permet d’aborder l’étude de la plasticité neuronale, de la régénération axonale, ainsi que de la réparation cellulaire. La lumière impressionne la rétine, qui est connectée à différents noyaux cérébraux. Si un œil embryonnaire est greffé au sommet du crâne chez un rat nouveau-né énucléé unilatéralement, l’illumination du transplant produit le réflexe pupillaire, avec effet additif si l’œil normal est aussi illuminé. Peter Coffey a montré par des méthodes électrophysiologiques et par marquage rétrograde, à l’aide de la peroxidase de raifort (HRP), que le nerf optique issu de l’œil greffé pénètre dans le cerveau et se connecte au pretectum, au colliculus supérieur, mais pas au noyau suprachiasmatique. Cette connexion est fonctionnelle puisqu’il est possible d’apprendre au rat greffé à réagir à un stimulus lumineux impressionnant l’œil greffé. Cette reconnexion peut également se faire après coupure du nerf optique et implantation d’un fragment de nerf sciatique suffisamment long pour atteindre les centres optiques cérébraux. Ces recherches permettent aussi de considérer la possibilité d’empêcher la dégénérescence neuronale, notamment dans les modèles animaux de rétinite pigmentaire ou de dégénérescence maculaire. Ces maladies neurodégénératives sont liées à une altération des cellules pigmentaires phagocytant normalement les cellules photoréceptrices. Selon Peter Coffey, il est possible de tester l’efficacité des greffes de ces cellules en analysant l’intégrité du processus visuel.

Un aspect important du développement du système nerveux concerne les mécanismes responsables de la croissance et du guidage des axones. Certains de ces mécanismes ont un effet général, d’autres agissent spécifiquement sur certains types d’axones.

Par des expériences de greffes, Kathryn Tosney (université du Michigan, États-Unis) montre que les axones sensoriels et moteurs, ainsi que les cellules de crête neurale, évitent toutes les régions qui expriment un glucide liant la PNA (peanut agglutinin). Tel est le cas du mésoderme qui entoure la notochorde, du dermomyotome à un stade précoce ou de la ceinture pelvique (sic). Lorsque le dermomyotome se sépare en myotome et dermatome, il cesse d’être PNA+ et produit une substance diffusible de nature inconnue, qui favorise la migration des neurites et des cellules de crête. Kathryn Tosney étudie sur des cultures de somites, dont l’architecture est maintenue, la migration des axones sensoriels et moteurs. Elle établit que les tissus permissifs, tels que la partie antérieure du somite, produisent un signal diffusible qui favorise l’extension des filipodes du cône de croissance. Au contraire, la partie postérieure du somite renferme une substance qui inhibe localement la croissance des filipodes.

L’intervention d’Olivier Pourquié (Institut d’embryologie cellulaire et moléculaire du Collège de France et du CNRS, Nogent-sur-Marne) concerne la protéine BEN (pour Bursal Epithelium and Neurons, aussi appelée SCI et DM-GRASP par d’autres auteurs), dont il a cloné le cDNA chez le poulet et qui présente un patron d’expression neuronal très intéressant au cours du développement embryonnaire. BEN appartient à la superfamille des immunoglobulines et paraît jouer un rôle dans la fasciculation axonale par le jeu d’interactions homophiliques. En particulier, BEN est exprimée par les fibres grimpantes de l’olive inférieure qui se projettent vers les cellules de Purkinje du cervelet, où il est présent selon des bandes longitudinales. Des bandes similaires existent dans les noyaux de l’olive, ce qui suggère que les fibres grimpantes BEN+ établissent des connexions avec les cellules de Purkinje, également BEN+ par un processus de liaison homophilique.

  1. Intérêt des greffes cérébrales embryonnaires dans l’étude de caractères innés du comportement ou de maladies génétiques du système nerveux

Ces recherches sont réalisées chez l’embryon d’oiseau. Elles consistent à localiser dans le cerveau, par le moyen de greffes neurales embryonnaires, le siège de certains comportements innés ou de maladies génétiques du système nerveux. Elles nécessitent que les embryons opérés, et qui sont à l’origine de chimères neurales du cerveau, puissent éclore. Le problème se pose donc du statut immunologique des greffes neurales.

Nicole Le Douarin décrit les travaux réalisés avec Masae Kinutani sur ce sujet. Les greffes neurales hétérospécifiques (entre caille et poulet) sont tolérées pendant une période de deux à quatre mois après la naissance, au terme de laquelle elles sont l’objet d’un rejet qui se manifeste par une maladie neurologique. Celle-ci s’apparente aux lésions observées dans l’encéphalomyélite allergique expérimentale induite par l’administration à un animal sain d’antigènes neuraux, tels que la protéine basique de myéline. La tolérance postnatale observée est due au statut privilégié du tissu neural, dont les cellules n’expriment pas les molécules du complexe majeur d’histocompatibilité (MHC) et sont protégées des cellules immunitaires par la barrière hématoméningée.

Ce statut privilégié est sans doute responsable de la tolérance parfaite observée lorsque les greffes neurales embryonnaires sont réalisées en situation allogénique (entre poulets différant par leur MHC).

La situation immunologique des greffons permet donc de réaliser des observations comportementales, pendant les semaines qui suivent la naissance chez les chimères caille poulet et pendant une durée prolongée chez les chimères réalisées entre poulets de souches différentes. Cette possibilité a été mise à profit dans deux types d’investigations.

Les recherches d’ Evan Balaban (Neuroscience Institute, La Jolla, États-Unis) porte sur la base cellulaire des différences de comportement entre espèces. Des greffes de régions précises de l’ébauche du système nerveux central entre des embryons de caille et de poulet ont eté réalisées à des stades précoces du développement, quand le système nerveux existe sous une forme rudimentaire. On laisse alors les embryons hôtes se développer et éclore. Les animaux qui en résultent ont des régions définies du SNC constituées de cellules de l’espèce donneur. On peut contrôler histologiquement l’origine de ces régions en utilisant le marqueur cellulaire nucléaire spécifique de l’espèce. Par l’étude détaillée du comportement spécifique de ces deux espèces et de leurs chimères, il est possible de déterminer expérimentalement quels sont les groupes cellulaires qui doivent être transplantés, afin de transférer le comportement de l’espèce hôte à l’espèce donneur. Après avoir identifié ces groupes cellulaires, la nature exacte de leur différence entre espèces est déterminée sur le plan morphologique, pharmacologique et physiologique. Des données ont été fournies, démontrant qu’au moins deux aspects distincts d’un comportement vocal stéréotypé, le “chant” (crowing), caractéristique de l’espèce donneur, peuvent être transplantés à l’espèce hôte par des greffes de régions définies du cerveau présomptif. Des greffons contenant le mésencéphale confèrent les propriétés temporelles du chant du donneur, tandis que des greffons de tronc cérébral (plus postérieur) confèrent le modèle donneur du mouvement de la tête pendant le chant.

Robert Naquet (CNRS – Institut Alfred Fessard, Gif-sur Yvette), Cesira Batini (laboratoire de physiologie de la motricité, université Pierre-et Marie Curie, CHU Pitié Salpêtrière, Paris), et Marie-Aimée Teillet ont utilisé les greffes intracérébrales pour étudier les caractéristiques neurologiques d’une forme génétique d’épilepsie réflexe chez le poulet. Des stimulations lumineuses intermittentes, ainsi que des stimulations sonores intenses déclenchent des crises de “grand mal” chez les poulets de la souche FEpi isolée dans les années 1970 par R. D. Crawford. Il s’agit d’une mutation autosomique récessive dont le gène est actuellement inconnu, mais qui confère au poulet une forme d’épilepsie réflexe pouvant servir de modèle animal pour des anomalies similaires connues chez l’homme.

Des greffes de neuroépithélium ont été réalisées entre poulet normal (hôte) et poulet épileptique (donneur). Elles ont montré que la maladie peut être transférée d’un poulet porteur de la mutation à un poulet sain par la transplantation du mésencéphale. Les similitudes observées entre les formes réflexes d’épilepsies photiques humaines et celles du poulet permettent de considérer que, chez l’homme comme chez l’oiseau, il s’agit d’épilepsies dont le siège est dans le tronc cérébral, plutôt que dans les hémisphères cérébraux.

Manfred Gahr (Max-Planck Institut, Seewiesen, Allemagne) utilise les chimères caille-poulet pour étudier le dimorphisme sexuel. Ses premières expériences ont consisté à greffer le cerveau entier d’un animal d’un sexe sur un animal du sexe opposé. Les femelles ayant reçu un cerveau mâle se comportent comme des femelles. Les mâles avec un cerveau femelle se comportent comme des mâles. Les gonades semblent donc induire une modification cérébrale qui a conduit Manfred Gahr à s’intéresser à l’expression des récepteurs aux œstrogènes, androgènes et à la progestérone, dans les zones présentant un dimorphisme sexuel, comme l’hippocampe et l’hypothalamus.

Il a pu montrer que, chez la caille, les récepteurs aux œstrogènes sont exprimés dans les régions pré-optiques, ce qui n’est pas le cas chez le poulet. Le même phénotype est retrouvé chez le poulet ayant reçu un cerveau de caille.

La dernière partie du colloque a porté sur l’utilisation des greffes neurales chez l’adulte, dans le but de réparer les lésions du système nerveux provoquées soit par des traumatismes, soit par des maladies dégénératives.

  1. Greffes neurales chez l’adulte à but thérapeutique

Ann Kato (Centre médical universitaire, Genève, Suisse) utilise la méthode de transplantation pour mettre au point un traitement d’une maladie dégénérative de la moelle épinière : la sclérose latérale amyotrophique. Cette affection, dont la cause est inconnue, touche environ 7 personnes sur 100 000 et conduit à un affaiblissement moteur mortel après deux à quatre ans d’évolution. Il existe plusieurs modèles génétiques chez la souris, comme les mutants Wobbler, MND (Moto-Neuron-Disease) et PMN. Ces dernières présentent un affaiblissement musculaire déjà marqué à la troisième semaine de vie, conduisant à la mort à la sixième semaine. Ann Kato a présenté des travaux visant à inhiber la mort des motoneurones à l’aide du CNTF. La demi vie de cette molécule étant faible (3 minutes), elle a choisi d’utiliser une méthode permettant de délivrer le CNTF de façon continue. Il s’agit d’encapsuler des cellules BHK transfectées pour produire le CNTF. Ces capsules sont implantées sous la peau des souris PMN entre le dixième et le vingtième jour de vie, à proximité de la moelle épinière. La durée de vie de cet animal passe de 42 jours à 63 jours en moyenne et une survie des neurones du nerf facial est obtenue. Le nombre d’axones myélinisés détectés au niveau du nerf phrénique est aussi augmenté. L’adjonction au CNTF du BDNF et de la neurotrophine-3 augmente encore la durée de vie jusqu’à 90 jours. Le GDNF n’a pas d’effet sur la suivie des souris. Ann Kato rapporte que l’intégration du gène bcl-2 dans des conditions de surexpression ne favorise pas la survie des souris PMN.

Jacques Mallet (CNRS, Gif-sur-Yvette) a souligné l’intérêt de l’adénovirus pour transférer des gènes dans le système nerveux central. Le gène marqueur β-galactosidase couplé à un signal d’adressage nucléaire est utilisé pour marquer les cellules infectées, qui peuvent être de type neuronal, glial ou épendymaire, notamment si le virus est injecté dans le ventricule. L’adénovirus est transporté de manière rétrograde, en particulier par les neurones dopaminergiques, lorsqu’il est injecté au niveau des terminaisons nerveuses. L’expression est encore observée trois mois après l’injection. Des cellules gliales infectées in vitro survivent à la transplantation et expriment le transgène jusqu’à cinq mois après la transplantation. Ce système de transfert de gène est actuellement en développement pour mieux comprendre l’expression de promoteurs neuronaux in vivo, comme celui du gène codant des enzymes de synthèse de neurotransmetteurs.

Philippe Horellou (CNRS, Gif-sur-Yvette) a montré l’intérêt de ce système pour exprimer un gène à activité physiologique, comme la tyrosine hydroxylase (TH), dans un modèle animal de la maladie de Parkinson. Des lignées cellulaires, qu’il a infectées par des rétrovirus exprimant la TH, synthétisent et sécrètent en grande quantité la L-DOPA. Le modèle animal de la maladie de Parkinson utilisé est obtenu chez le rat par lésion unilatérale de la voie nigro-striée par la 6-hydroxydopamine. Les rats lésés présentent un comportement rotatoire induit par l’apomorphine qui est utilisée comme index quantitatif du déficit dopaminergique. La greffe intrastriatale des lignées sécrétant la L-DOPA compense le comportement rotatoire. L’analyse par microdialyse a montré que les cellules sécrétant la L-DOPA sont plus efficaces pour augmenter les taux en dopamine extracellulaire que des cellules sécrétant la dopamine. Des cellules astrogliales modifiées génétiquement par un rétrovirus recombinant pour la TH permettent de même de compenser les déficits en dopamine au moins trois semaines après la transplantation.

L’expression à long terme du gène de la TH dans ces cellules pose encore quelques problèmes. L’adénovirus peut aussi servir d’outil pour transférer directement des gènes aux neurones du système nerveux central, comme l’a montré Jacques Mallet. Philippe Horellou a évalué la capacité fonctionnelle de ce système dans le modèle de la maladie de Parkinson. Un vecteur adénoviral recombinant pour la TH a été injecté dans le striatum. Un grand nombre de cellules astrocytaires et neuronales expriment la TH dans le striatum dénervé. L’utilisation de cellules nerveuses embryonnaires d’origine humaine est actuellement à l’étude.

Anders Björklund (université de Lund, Suède) a présenté ses travaux sur un modèle de trouble mnésique chez le rat. Certains rats âgés de plus de deux ans montrent une altération significative du temps qu’ils mettent pour trouver une plate-forme dans une piscine dite de Morris. Le nombre des cellules cholinergiques impliquées dans la mémorisation, localisées dans le noyau basal de Meynert n’est pas modifié, mais leur taille diminue. Des mini-pompes, qui permettent d’administrer des facteurs trophiques tels que le NGF ou la neurotrophine-3, mais pas le BDNF, augmentent la taille des cellules au niveau du site d’implantation de la pompe. Anders Björklund teste aussi la délivrance du NGF par une lignée cellulaire infectée, avec une construction rétrovirale surexprimant le NGF de souris. Le taux de NGF produit après une greffe de 50 000 de ces cellules est très important (environ 4 000 pg/heure), ce qui représente au moins un facteur 10 par rapport aux autres expériences sur le même thème. Ces cellules se multiplient. La plupart restent indifférenciées, bien que 1% soient neuronales et 10% gliales.

Cette dernière proportion augmente avec le temps, puis est augmentée de 50% si la greffe est réalisée dans un site gliotique. Ces cellules produisent une hypertrophie cellulaire d’environ 30%, qui reste détectable dix semaines après la greffe, indiquant une sécrétion soutenue. Les performances mnésiques sont améliorées quatre semaines après la greffe. La taille des cellules exprimant le récepteur à basse affinité pour le NGF, dont les cellules cholinergiques, est augmentée significativement dans le septum et dans le noyau basal de Meynert.

En conclusion, ce colloque a eu le mérite de montrer que les greffes neurales sont non seulement une méthode puissante d’investigation embryologique, mais aussi une voie thérapeutique d’avenir.

Abréviations

BDNF : Brain-derived Neurotiophic Factor; BEN : Bursal Epithelium and Neurons; bFGF : basic Fibroblastic Growth Factor; BHK : Baby Hamster Kidney; CNTF : Ciliary Neurotrophic Factor; CPs : cellules de Purkinje; Dil : Dicarbocyanine dye; FEpi : homozygous Fayoumi Epileptic ou Fayoumi homozygote épileptique ; GDNF : Glial cell line-derived Neurotrophic Factor ; HRP : Horseradish Peroxidase ou peroxidase de raifort; MHC : Major Histocompability Complex ou complexe majeur d’histocompatibilité ; MND : Moto-Neuron Disease; NGF : Nerve Growth Factor; PDGF : Platelet-derived Growth Factor; PMN : Progressive Motor Neuronopathy ; PNA : Peanut Agglutinin ; SNC : Système Nerveux Central ; TH : Tyrosine Hydroxylase.

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